主管【95820】鹦武喙羽病病毒和禽众瘤病毒全基因组序列的领会及鹦鹉喙羽病病毒ORFC1原核外达.pdf
Genome ofAvian and Analysis Polyomavirus and DiseaseVirus andFeather PsittacineBeak Beak ORFC1ofPsittacine ofthe Expression Virus andFeatherDisease Thesissubmittedto University Agricultural Qingdao ofthe InFulfillment Requirement forthe of Degree Masterof Agronomy ZhuangQingye Scienceand ofAnimal Technology) (Department Baoxu Supervisor：Prof．Huang Chen Jiming Han Xianjie Qingdao．China Jnne，2010 IUllnlllllilillllll11111UI Y2353738 目次 摘要………………………………………………………………………………………………………．1 ABSTRACT…………………………………………………………………………………………………3 缩略词外…………………………………………………………………………………………………。5 文献综述……………………………………………………………………………………………………．．6 1禽众瘤病毒濡染症………………………………………………………………………………………6 2鹦鹉喙羽病………………………………………………………………………………………………1l 3磋商的目标道理………………………………………………………………………………………．．14 试验一禽众瘤病毒濡染症及鹦鹉喙羽病的PCR检测………………………………………………。16 1试验资料………………………………………………………………………………………………．．16 2手腕………………………………………………………………………………………………………18 3结果与领会………………………………………………………………………………………………23 4接头………………………………………………………………………………………………………．31 5结论………………………………………………………………………………………………………33 试验二禽众瘤病毒及鹦鹉喙羽病病毒的全基因组测序及序列领会…………………………………．34 1试验资料和手腕………………………………………………………………………………………．．34 2结果………………………………………………………………………………………………………36 3接头………………………………………………………………………………………………………47 44、l吉………………………………………………………………………………………………………48 试验三鹦鹉喙羽病病毒ORFCl基因的克隆与原核外达………………………………………………49 1资料………………………………………………………………………………………………………z19 2试验手腕………………………………………………………………………………………………．．5l 3结果………………………………………………………………………………………………………55 4接头………………………………………………………………………………………………………59 5，J、结………………………………………………………………………………………………………61 改进．点……………………………………………………………………………………………………。62 参考文献…………………………………………………………………………………………………．．63 C0NTENTS Abstract．．．．．．．．．…．…．．．．．．……．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．，．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．……………．．．1 abstract．．…．．．．．．…．．．．．．．……．．．．．…．…．．．．．．………．．．．．．…．．．．…．．．．………．…………．．．…．．．…．3 English Abbreviation Key…．…．．…．．．……．．．．．．……．．．．．．………．．．．．……．．．．…．………………………………．…5 Summary．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．…．．．．…．．……．．．．．．．．．．．．，．．．6 1 Avian infection．．，．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．……．．．．．……．．．．．．．．．．．．．．．6 Polyomavirus 2PsittacineBeakand FeatherDisease．．．．．．．．．．．．．．．．…．．．．…．．．…．…．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．11 3Researchand purposemeaning……．．．…………………………………………．．．．……．．．．．……．．．…．．．14 onePCRdetectionofAPVandPBFDV．．…．．．．…．．．．．．．．．．．．．，．．．．．．．．．．．．．．，．．．．．．．．．．．．．…．…．．．16 Experiment 1 Materials．．…．．．．．．．．．．．…．．．…．．．．．．．．．……．……………．．．…．．．．……．…．．．．，……．…．．．．…．．．．．．．…．．．．．16 2Methods．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．…．…．…．…．．…．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．18 3Result……．．．…………………………………．．．．．………．．．……．．．……．．．…．……．．．．．．………………23 4Discussion……………………………．。。………。．……。…．。．…………………。…………………．……。．31 5Conclusion…．…………．……．……．．…．．………．．．………．．．．………．．……．．．．．………………………33 ExperimenttwoSequencinganalysisofAPV I Materialsand method………．．…．．…．…．．．……．．．．．．……．．．…．……．．．．．．………………………．．……3zI 2Result．…．．．．．．…．．．．．…．…．．．…．．．．．．．．……。．。…．…．…．．．。…。．。…………。…．……。．．…。．．．．…．．．…．．．…36 3Discussion．．．．．．…．…．．．．．．…．．…．．．．．…．．．．…．…．．．．．…．…．．……．………．…．．．．．．．……．．．．．．．……．．．．．d17 4Conclusion．．．．．．．…．．．．…．．．．．．．．．．…．…．…．．………．．．………．．．…．．．………．．．．．．．．．．．．．．．．…．．．．……．．．48 ofPBFDV…………．．…………………．49 ExperimentthreeCloningandprokaryoticexpressionofORFCl 1 Materials．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．，．．．．．．．．．．．．．．．．．，．．．．．．．．…．．．．．．．．．．…．．…．．49 2Method．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 3 Result．．．．…．…．………．………．．．．．．．…．．．．．．．．…．……．．…．．．．．……．．．．．．．．．．…．．……．．．…．．．．……．．．．．55 4Discussion………………．．………．………．．．………．．．………．．．．．……………………………………．．59 5Conclusion………………．．．．．……．．．…………，……．…．．．…．…．．．…．…………………………．．．．…．．．61 Innovation．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．，．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．……．．．．．．．…．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．，，．．．．．．．．．．．62 References．．．…．．……．．．．．．…．．．…．．…．．…．．．…．．………．．．．．．………．．．．．．．．…．．．．．．．．．．．．．．…．．．．．．…．…．．．(；：； 青岛农业大学硕士学位论文 摘要 摘要 禽众瘤病毒濡染症(Avian Polyomavirus BeakandFeather (Psittacine Disease，PBFD)被以为是影响禽类羽毛和外观的两大代外性 病正在我邦台湾有过报道，正在大陆还未尝睹过报道。APV濡染症，又称鹦鹉小雏病，主 要惹起鹦鹉小雏的急性致死性疾病，其去世率可高达100％。本文要紧完工了以下事务： 合濡染，PCR产品序列领会的结果可能确认本病例鹦鹉有PBFDV和APV的濡染，这是我 邦大陆初度报道鹦鹉喙羽病，也是我邦大陆初度报道皋比鹦鹉APV和PBFDV的羼杂感 染。 果领会可知，本文辞别到了2株APV辞别株，一株为青岛株QD．JM01，一株为潍坊株 辞别到的第一株PBFDV。 基调动，此中VPl变异率最高，有5个碱基位点爆发调动。其次T抗原变异率较高， 有4处碱基爆发调动，此中，VPl区域及T抗原别离有4个位点惹起氨基酸变异。PBFDV 4．0软件构 小以及处所，位于Cap和Rep之间的茎环机合的序列及处所等。愚弄Mega 修体系进化树，领会证明这些同源性极高的APV辞别株，与地舆漫衍没有显然联系， 并褂讪成地舆隔绝，与宿主也不呈显然联系；根源于分别宿主的PBFDV辞别株与宿主 联系慎密，与地舆根源也呈必然干系，我邦的QD．CN01辞别株位于由6株辞别自日本 的辞别株组成的皋比鹦鹉特异基因型分支上。 青岛农业大学硕士学位论文 摘要 达的PBFDV重组衣壳卵白可能动作免疫原制备抗血清及单克隆抗体，也为研制基因工 程疫苗和诊断试剂盒供应必备的筛选用试剂。 合头词：APV；PBFDV；克隆；外达 青岛农业大学硕士学位论文 Abstract Abstract Avian and beakandfeather themosttwo polyomavirus(APV)infection psittacine disease(PBFD)are commonviraldiseasesthatCan affect havesimilarclinicalmanifestations frequentlypsittacinebirds，which characterizedfeatherdisorders．PBFDVto Circovirusofthe by belongsgenes family affectsover60 ofwildand birds．PBFDhasbeen in never species captivepsittacine reportedTaiwan，but inMainlandChinabefore．APV called repoted infection，also Budgerigarfledgling acutefataldiseasein witha rateof to1 00％．Therearethree inthe youngbudgerigar mortalityup parts Inthefirst Chain Wastherefore toascertain part，Polymerase Reaction(PCR)methodologyemployed whetherAPVorPBFDV was innineaffected undulates in genomepresent Melopsittacussamples this ofnine detection，six Undulatesshowed showed Shandong，China．In Melopsittacus APV-positive，one showeddual Wasthefirst of infection，this PBFDandthefirst ofdual PBFDV-positive，two report report infectionwithAPVandPBFDVin undulatesinMainlandChina． Melopsittacus Inthesecond ofAPVstrain and part，by WF-GM01， fragmentamplification，thegenome QD-JM01 thePBFDVstrain 1 isolatedfrom were and QD—CN0 Shandongprovincesequenced analyzed． Blast andDNAstarsotb,vare indicatedthatthetwoAPVstrainsboth analysis analysis revealeda the with APV inGenBankinthenucleotide highlyhomologypublished sequences level．Byalignment，a 14 was insertionobservedinthe of 01 straininnucleotide bp non-codingQD—JM 246，the region position evaluationresults a comparative revealedtotalnumberof11 base threeofwhich pairexchanges，only resultedinthe ofaminoacids．ForWF—GM01 strain，the evaluationresultsrevealed exchange comparative a 14 totalnumberof base revealedthe mutation fivebasessites pairexchanges．VPlhighest rate．totally outoffivecausedaminoacids T basesites changed，four exchange．Inlargeantigenregion，four showed causedaminoacidsvariation．ThePBFDVisolates 1 strain thesamebasic exchange，all QD-CN0displayed as structurethat describedfor the oftheORFsandthe genome previously PBFDV,includingpositions structurelocatedbetweenthe andCP ofthe is2003 stem-loop Rep genes．Thelength genome bp，Blast thatthePBFDV derivedinthis hada withthe PBFDV suggested sequence study homology published in the GenBankfrom83．0％to95．0％innucleotide treeWas sequences ranged level．Phylogenetic constructed4．0．ItWasindicatedthattherewererio withthe byMega significant relationshipspecies andthe locationoftheAPV alsoindicatedthatthe specificitygeographical isolates．Phylogeneticanalysis 3 青岛农业大学硕士论文 Abstract PBFDVisolateshave withthe andthe locationof significantrelationshipspecies specificitygeographical the 1 isolateclusteredwithsix isolates．QD-CNO isolatesisolatedfrom undulates Japanese Melopsittacus Inthethird of was to part．a beakandfeatherdisease pairprimersdesignedaccording psittacine inGenBank to the flameC (PBFDV)sequencesamplify ofPBFDV completeopenreading I(ORFC1)gene isolationstrainfrom PCR wastheninsertedintothe Shandongprovince(QD-CNOI)．The product vectorPET-32a．On prokaryoticexpression theidentificationofECORIand IIand BgI sequencing，the recombinant weretransformedintothe cellsofE．coliBL2 C1 was plasmids competent 1．Finally,thegene inE．coli this highlyexpressed aimwasto a PBFDV expressionsystem．Instudy,themajor produce ORFC1。encodedrecombinant thatwouldhave asa Capsidprotein vaccineandasa applicationpotential for as testssuchELISAandWestern specificantigenserologicaldiagnostic immunoblotting，andprovided avisionto vaccinefor developgeneticengineering diagnosis． Keywords：APV；PBFDV；Clone；Expression 4 青岛农业人学硕十学位论文 缩略词外 缩略词外 简写 英文全称 中文全称 Amp Ampieillin 氨苄青霉素 bp basepair 碱基对 dNTP Deoxyribonucleoside 脱氧核糖核苷三磷酸 triphosphate EDTA tetraacetateacid Ethylenediamine 乙二胺四乙酸 ELISA immunosorbent Enzyome—linked assay 酶联免疫吸附试验 EB Ethidium bromide 溴化乙啶 IPTG Isopropyl—p—D—thiogalactoside 异丙基硫代．B—D．半乳糖苷 KD(kilo)Dalton (千)道尔顿 LB Luria—Bertani Medium LB提拔基 APV Avian Polymavirus 禽众瘤病毒 PBFDVPsittacineBeakand FeatherDiseaseVirus 鹦鹉喙羽病病毒 M Mol／1 摩尔每升 nnl Nanometer 纳米 OD Opticaldensity 光密度 PAGE Polyacrylamidegelelectrophoresis 聚丙烯酰胺凝胶电泳 PBS saline phosphate-buffered 磷酸盐缓冲液 PCR chainreaction Polymerase 荟萃酶链式反响 Rotation minute rpm per 蛾食 SDS Sodium sulfate dodecyl 十二烷基磺酸钠 Ym Melting temperature 组熔化(变性)温度 TMB 3，3’，5，5-Tetramethylbenzidine3，3’，5，5’．四甲基联苯胺 U Unit 阜也 一————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————一 5 青岛农业大学硕士学位论文 文献综述 文献综述 们喜好喂养的宠物。鹦鹉的分类凭据样式、剖解学、觅食活动、分子生物学及地舆漫衍 等，各有分别。鹦鹉目遵从科种可分为凤头鹦鹉亚科、吸蜜鹦鹉亚科、鹦鹉亚科。鹦鹉 ofAsia&Pacific (Parrots Parrots)、锥 P 尾鹦鹉(Conures)和澳洲长尾鹦鹉(Australian arakeets)等。 进入20世纪后，因为航空交通起先方便，大型野生鹦鹉起先正在欧美被寻常喂养，直 到1992年美邦禁止保育类鹦鹉的进口，鹦鹉养殖业才起先振起。这日鹦鹉的养殖技巧已 经相当成熟，近年来，鹦鹉养殖正在我邦北京、青岛、湖北省云梦县等地变成必然界限。 据报道，仅湖北省云梦县就有500众养鸟专业户，养殖10众万对鹦鹉，每年收入200万元 以上。青岛即墨喂养鹦鹉已有20年史册。邦内喂养鹦鹉固然较为普通，但除大绯胸鹦鹉、 绯胸鹦鹉、花头鹦鹉等3种我邦固有品种正在民间及动物园有少量喂养外，人工喂养的鹦 鹉品种大家来自外洋，要紧是皋比鹦鹉和牡丹鹦鹉之类的小型鹦鹉。 正在喂养鹦鹉历程中，常睹的疾病有呼吸器官病、消化器官病和寄生虫病等。其它， 鹦鹉热，又称饲鸟病，是一种自然疫源性疾病，病原是一种衣原体，目前己察觉海鸥、 鸽子、金丝雀、相思鸟、红雀、苍鹭、鸡、鸭等190余种鸟类和家禽可撒播此病，也能 disease，BFD)，又称 濡染人。常睹的病毒性疾病中，鹦鹉小雏病(Budgerigarfledgling 禽众瘤病毒濡染症(Avian Beakand Polyomavirusinfection)，和鹦鹉喙羽病(Psittacine Feather J。 外，腺病毒濡染也被证明过ii 与古板禽乌业比拟，鹦鹉养殖是一个年青的家当，具有开阔的繁荣前景。自信跟着 邦民物质、精神、文明、壮健等须要的日益拉长，人类对抚玩鸟的需求认识逐渐抬高， 以及邦内邦际市集的无间开采，鹦鹉养殖业将正在满意邦外里市集需求的同时获得缓慢发 展。目前，我邦对鹦鹉疾病的干系磋商相对来说较量单薄，干系磋商原料较量少，本文 中，针对禽众瘤病毒濡染症和鹦鹉喙羽病举办PCR检测，并对揭示病毒的全基因组信 息，对病毒举办举办分子生物学个性及病毒辞别等方面的干系磋商，对通行病学的磋商 奠定根基，对我邦鹦鹉类疾病的防御及操纵具有紧要道理。 1 禽众瘤病毒濡染症 青岛农业大学硕士学位论文 文献综述 1．1禽众瘤病毒濡染症的史册配景 禽众瘤病毒濡染症(Avian Polyomavirus disease，BFD)，是由禽众瘤病毒(Avian fledgling 鹦鹉雏鸟去世的急性病毒性流行症。80年代初该病开始正在美邦和加拿大报道，随后，迅 速伸张到日本、意大利、匈牙利、德邦和澳大利亚等地【2,31，分别地分辨离的APV具有相 当高的相同性。1994年2月，鹦鹉小雏病初度正在我邦湖北省云梦县的某集约化鹦鹉养殖 基地爆发暴发通行；1994年7月正在青岛胶州某个别鹦鹉养殖场形成广大耗损；2005年台 湾【4峙艮道了吸蜜鹦鹉的鹦鹉喙羽病病毒与众瘤病毒的羼杂濡染。该病现己正在我邦喂养鹦 鹉较众的很众省市如湖北、广东、山东等地广为撒播，并致紧张的危险和耗损。 APV要紧濡染出壳1．3周的鹦鹉，去世率到达80％【51，病症浮现为厌食、孱羸、皮下 出血、腹泻和呼吸障碍等症状【61，嗉囊常充足，内充满食品。粪便稀少，常呈淡绿色并 略带白色，病鸟常正在显示腹泻后1．5天去世。显然的临床特点还征求羽毛发育毛病，15 日龄以内的发病鹦鹉背部与腹部缺乏绒毛，颈部缺乏纤毛；15日龄以上的鹦鹉尾羽和廓 羽发展受损；25日龄以上耐过本病的鹦鹉，羽毛又起先发育，但个别瘦小，羽毛永远发 育不全，遗失抚玩价格和经济道理。成鸟濡染APV常会有猝死而无临床症状，正在急性感 染时慢性疾病症状如厌食、脱羽、体重低落等也会显示，更会继发细菌或霉菌濡染。 1．2禽众瘤病毒的病毒个性及分类 Avian 均不敏锐，具有较强的平静性，于4V，25。C，37℃条款下均不凝聚鸡、火鸡、鹦鹉、豚 鼠和人O型红细胞峰J。 基因组分为早期浮现区、晚期浮现区及非编码区。早期浮现区包蕴大T抗原、d,t抗 Frame，OR_V)。众瘤病毒的大T抗原是一个众性能卵白， 原的怒放阅读框(OpenReading 合机合域及宿主界限机合域，具有指导病毒的复制、转录、拼装、转化等性能f81。4,t 抗原与大T抗原正在氨基端有83个好像残基，dt抗原大概协助大T抗原转化细胞或者与细 胞卵白联络。晚期浮现区包蕴两类ORF，一类ORF转译出三个紧要的机合卵白vPl、VP2、 性抗原。另一类ORF转译出其它4种性能不详的机合卵白。第一对未知卵白为agno．1a和 青岛农业大学硕士学位论文 文献综述 agno—lb，第二对未知卵白 早期、晚期启动子和巩固子序列。 1．3禽众瘤病毒的致病性 APV濡染症与被濡染鸟的岁数、种类及个别个性皆相合系。APV濡染惹起的去世率 与鸟龄相合，凭据鸟龄的是非，去世率正在25％～100％之间。成鸟相对小鸟对疾病有必然 的耐受性。正在病毒举动的岑岭期，15日龄或更小的小鸟发病率为100％，去世率高达90％ 以上，三周龄成鸟去世率正在30％．80％。非鹦哥类的鹦鹉濡染APV，高危机的雏鸟去世率 正在27V旷4 衷鹦鹉(EclectusParrots)、环颈鹦鹉(Ring—neck 于是，现正在常用APV濡染症代替BFD。 APV濡染症对皋比鹦鹉来讲，自然濡染APV的皋比鹦鹉去世率岑岭正在第15～19天， 于是湮没期该当小于15天，而试验濡染APV的小鸟经肌肉打针后1l天去世。雏鹦鹉孵出 后l周内发育基础寻常，7日龄以上浮现精神萎顿，10曰龄起先腹部肿胀、皮肤发红、腹 泻、瘫痪，大家半于腹泻显示1—5天去世。lO．15日龄的小皋比鹦鹉大概正在尚未显示临床 症状前就急性猝死。未爆发猝死的小皋比鹦鹉背部与腹部缺乏绒毛，颈部缺乏纤羽，有 时还会显示神经症状，如头颈震颤、共济失调。15同龄以上的鹦鹉尾羽和廓羽发展受阻。 25日龄以上耐过本病的鹦鹉，羽毛又起先发育，但个别瘦小，羽毛永远发育不全，遗失 抚玩价格和经济道理。普通来说，一个月龄以上皋比鹦鹉，以及五个月龄以上的其它鹦 鹉，纵然接触病原，也不必然会发病。 非皋比鹦鹉类鹦鹉自然濡染APV，从濡染到起先发病可能是10一14天，其羽过错变 不如皋比鹦鹉紧张。一再为不显性濡染，可分为超急性、急性及慢性濡染三种。超急性 濡染的雏鸟大概猝死，而急性濡染的临床症状征求精神重郁、厌食、体重、嗉囊排空延 迟、食品逆流、共济失调、瘫痪、皮下出血、呼吸障碍。患病鸟只极易出血，肌肉打针 或是羽毛被拔出城市大批出血。慢性濡染的临床症状征求体重低落、问歇性厌食、众尿、 羽毛发育不全以及二次性濡染等。 1．4禽众瘤病毒濡染症的剖检病变及构制学转变 病理剖检鹦鹉小雏病患乌，可睹病变要紧鸠集正在心脏、肝脏和肾脏。心脏肿大，心 包积水；心脏外观可睹针尖巨细灰白色病灶或出血斑。肝脏肿大，外观有黄白色或玄色 坏死灶，并伴有小出血点，呈大理石样外观。肾脏淤血、肿大，外观有针尖巨细坏死点： 青岛农业大学硕十学位论文 文献综述 慢性濡染可睹榜样的“花斑肾”，为尿酸盐重积所致。其它，局部病死鸟伴有嗉囊积食、 肠腔积液并有坏死物变成肠栓、腹腔积水、肺水肿等症状。正在继发性细菌濡染病例中， 可睹全身败血症症状。构制病理切片查抄，正在皮肤、心、肝、脾、脑构制等处大概查睹 核内宥恕体【6J。 非鹦哥类鹦鹉病理剖检可睹肝脾肿大，肝脏可睹散正在黄色病灶。心脏映现惨白色伴 有心脏出Jf【L。肾脏肿大，出血。局部骨骼肌也映现出惨白色。皮下、小肠等处亦可睹出 血症状，提示大概显示寻常性出血。病变构制切片可睹心、肝、肾等构制存正在坏死及炎 症反响。皮肤、心脏、肝脏、肾脏、脾、脑构制、羽毛、羽毛囊等部位的构制切片大概 杏睹核内宥恕体Ⅲ1。 1．5禽众瘤病毒濡染症的通行病学 APV濡染途径可分为秤谌撒播及笔直撒播。秤谌撒播系病毒随羽毛、皮屑和尿液粪 便排出，万鸿娱乐平台-首选APP经气雾秤谌撒播，再经由口腔或呼吸道濡染，以及亲代鸟正在濡染后的病毒血症 2‘15J。 岁月正在反刍喂食雏鸟时，将带有病毒的消化上皮细胞沿途喂食给雏鸟而形成濡染【l 将市集上未售出的小鸟带回养殖场，形成疫病暴发也是紧要因为。喂养地相对鸠集，人 员来往过密，笼具互相串用等也都是秤谌撒播的紧要途径。本病还可经卵笔直撒播， DNA，这些都证据本病可经卵撒播，隐性带毒的成年鸟是本病不成轻忽的濡染源。笔直 撒播仅正在皋比鹦鹉中获得证明，其它鸟类未获得确定的证明。 似病例地域高去世率的鹦鹉，结果察觉血清阳性率为11％-45％，此中以金刚鹦鹉 并举办人口濡染试验，心脏、肺脏、肝脏等脏器正在病理切片下皆可睹微嗜碱性核内包蕴 体存正在，电子显微镜查抄可睹其病毒颗粒存正在【l引。1994年7月往后，青岛地域暴发通行 一种以15．30日龄小雏鹦鹉呈腹泻、羽毛发育毛病为临床特点的急性、高度致死性濡染 病，吴延功等人【6l证明由乳众空病毒科的众瘤病毒惹起。1995—1996年，正在我邦湖北云梦 县鹦鹉养殖基地发生通行一种流行症，大界限的鹦鹉小雏去世，去世率越过80％，寇铮 等【l 区的鹦鹉喂养场，以阻断酶联免疫吸附法(BlockingELISA)检测其喂养的129只五彩金 刚鹦鹉(scarlet 宠物鸟的通行病学视察中，对受测的1056只鸟中的877只举办了PCR检测，有7只映现阳 青岛农业大学硕士学位论文 文献综述 85只的鹦鹉举办检测，征求分别性别，分别岁数，固然结果全为阴性，但由于邻近邦度 仍有APV濡染症，于是提出仍然具有湮没濡染的危机【231。2005年，意大利所做的野鸟 视察中提出，APV也可能正在隼及红头美洲鹰平分离到【21i。 1．6禽众瘤病毒濡染症的诊断及医治 APV濡染症可按照其临床症状、剖检病变等作开始诊断。再凭据其构制病理学、病 原判定的结果作诊断。目前APV的试验室诊断手腕征求：免疫荧光抗体染色法 (immunofluorescentantibodystaining，IFA)[24,25]、中和试验(neutralizationtest；NT)[17,261、原 situ 位杂交技巧(in ELISA)1281、 电子显微镜法(electron ShuttlePCR) real．time 1271及及时荧光定量PCR(NovelPCR)[301等。 1984年，Lynch等[31J报道把鹦鹉病料悬液直接接种鸡胚或者鸡胚细胞提拔物不行得 到可检测到的鹦鹉小雏病病毒，但却也许使10日龄的鸡胚爆发病变。李天宪等【32】对湖北 的APV辞别株举办了原代细胞的合适性提拔，开始正在鹦鹉胚成纤维细胞盲传至第5代后 再过渡到鸡胚成纤维细胞提拔，设立了APV的合适细胞提拔体例。其它，APV病毒可正在 canine cell)提拔增殖，可形成胞质及胞核空泡变性的细胞 犬肾细胞(madin—darbykidney effects；CPE)[81。 病变(cytopathic APV去世率高、通行性广，各邦粹者对其从分别方面举办磋商，也接踵提出己方的 意见，但至今没有一种行之有用的防治手腕。上世纪八十年代初期，美邦Ritchie教养便 起先从事APV的疫苗研制事务，此中油乳剂灭活疫苗也正在必然界限内试用，但因为运用 鹉更具有潜正在易感性，他提出抗APV的抗体大概是阻遏濡染的有用手腕，否认疫苗是最 终的处置举措。2000年，中科院武汉病毒所采用生物学传代手腕诱导告成了弱毒株，利 法仍正在试验阶段，目前试验数据阐明没有有用的医治手腕，故应以防御为重。最好的预 防格式为疫苗免疫，外洋已有不活化疫苗可用于众种鹦鹉类鸟禽，成鸟或小鸟运用皆安 全有用，能有用防御及操纵本病爆发。 操纵疾病发生的格式，征求对已形成临床症状的患鸟及与患鸟接触的鸟只举办隔 离，并对成鸟及小鸟举办疫苗的接种，隔绝患乌及筛检出雏鸟，普通自信雏鸟是要紧的 青岛农业大学硕士学位论文 文献综述 排毒根源，于是该当将幸存雏鸟减少，就可能打断濡染的症结，而排毒中的患鸟应避免 与其它鸟只接触。自后察觉，年青的成鸟也会排毒形成子息濡染，因此年青的成鸟也必 须减少。正在疾病发生时刻，应以人工格式选取得当消毒药品对情况举办整理，彻底干净 被污染的修筑并举办消毒，消毒征求孵化舍、雏鸟及成鸟的鸟舍等区域及一齐运用的设 备。值得注意的是，APV正在情况中抗性很强，可经由乌只的羽毛、皮屑与排泄物举办排 毒，很众常例对众瘤病毒有用的消毒药品对APV无效。有用的消毒剂征求70％ethanol， synthetic chlorine phenol(1：256)，stabilizeddioxide(1：400)，sodium 同时须查明患鸟的根源，以使病毒不再不停撒播，防御此病重心正在于将孵化舍消毒及对 重生雏鸟接种疫苗。 检测受濡染鸟的排毒是防御APV撒播的要紧因素。因此，正在引进新鸟之前，最好都 能举办APV的筛检，检疫时问起码60到90天。不将无接种疫苗的鸟只举办混养，不把不 同根源的鸟只混养正在统一个鸟舍中，不将分别种类的鸟混养正在沿途，并正经节制职员的 进出。当鸟舍爆发濡染时，应速即逗留总共生息活动[25,34】。云云一方面可能删除成鸟紧 迫，有时分停滞形成好的免疫保卫力，另一方面也能避免不壮健雏鸟的形成。 2鹦鹉喙羽病 2．1鹦鹉喙羽病的史册配景 BeakandFeather 鹦鹉喙羽病(Psittacine 头鹦鹉中初度报道【351，伴跟着鸟类的全邦生意此病已撒播至全邦各地，征求英邦、德邦、 毒与众瘤病毒的羼杂濡染，蒋文雅等[3812008年报道正在我邦大陆青岛有鹦鹉喙羽病濡染。 PBFD可濡染约60种的野生鹦鹉及宠物鹦鹉。要紧濡染3岁龄以下小鸟，榜样的临床特点 是慢性的、渐近性的羽毛缺失，正在某些种类中，也可爆发喙和爪变形，及会损害免疫组 织器官并会控制免疫体系。纵然有的濡染禽可能存活众年，更众的情景是几个月至一年， 然后死于二次濡染细菌、衣原体或真菌。 其他鸟类的圆环病毒濡染症，鸽子圆环病毒病于1993年正在北美初度报道，随后接续 正在澳大利亚和很众欧洲邦度均有报道1391，普通情景下，鸽子可正在一月龄濡染。临床浮现 为精神重郁、昏睡、厌食、竞赛收获不佳。因为并发细菌、真菌或病毒濡染而显示的不 同的临床症状。1999年，Soike等报道了鹅被“仿佛圆环病毒”濡染而发病‘4们，鹅群外 现为发展迟笨、产蛋率低、去世率高，死鹅局部是因为继发濡染鸭出血性败血症及烟曲 霉菌病。 青岛农业大学硕士学位论文 文献综述 2．2鹦鹉喙羽病病毒的病毒个性及分类 Beak 经自然发病和试验濡染证明，鹦鹉喙羽病的病原为鹦鹉喙羽病病毒(Psittacine andFeatherDisease Virus，PBFDV)，与鸽子圆环病毒(Pigeon 病毒(Goose circovirus circovirus，GoCV)和猪圆环病毒(Porcine type2，PCV-2)协同组 anemia virus，CAV)因为其特殊的基因组机合被另列为一个属。该病毒为现存所知最小 且具病原性的动物病毒，为一呈二十面体对称的、单股、环状、无囊膜的DNA病毒，大 能凝聚粉红风头鹦鹉(Eolophusroseicapillus)、东部长嘴凤头鹦鹉(Cacatuatenuirostris)、 leadbeateril、甘凤头鹦鹉 葵花凤头鹦鹉(Cacatuagalerita)、米切氏凤头鹦鹉(Cacatua (Callocephalonfimbriatum)、戈芬氏鹦鹉(Cacatuagoftini)以及豚鼠和某些种类鹅的红细 胞。 (virion 质(867nt)。其氨基酸序列显示此中包蕴三性情能基序，其一为GPPGCGKSbox，与核酸 box及YCKS 锚定位点相合；其它两个基序，QGYF box，则与病毒复制相合【4¨。另一 为ORF2，可转译出--28．9 protein)。 其它ORF，先容如下：ORF3为480nt，转译出卵白质为17．7kDa：ORF4为318m，转译出 卵白质为11．2 白质为9．7kDa；ORF7为258nt，转译出卵白质为8．7kDa。 PBFDV复制格式与PCV、CAV好像，均为滚环复制(rolling 2．3鹦鹉喙羽病病毒的致病性 parrots)、恋爱鸟(Lovebirds)、皋比鹦鹉(Budgerigars)、非洲灰鹦(Afficangrayparrots)。 PBFDV的湮没期最短为21天，这与濡染病毒量、鸟的岁数、羽毛的发育阶段及免疫体系 的境况均相合。小于3岁数的鸟禽较易濡染PBFDV，但一齐岁数的鹦鹉科鸟类都可濡染 PBFDV。羽毛发育全部的鸟类正在脱毛之前不会显示临床症状，普通须要6个月以上的时 间才会显示脱羽症状。急性濡染大家爆发正在三岁以下的鸟禽，正在第一次长羽岁月(28．32 青岛农业大学硕士学位论文 文献综述 日龄)，鸟类会有重郁及脱羽情况，并会形成败血症性肺炎及肠炎，紧张时会致死，但 大家半去世病例众为二次性濡染形成，慢性濡染则正在换羽后爆发，以慢性渐进性、对称 性的羽毛发展不良和偶睹的嘴喙病变Ⅲ]。正在羽毛和羽毛囊上皮细胞中察觉核内和胞浆内 嗜碱性宥恕体。其它，PBFDV也会形成鸟只免疫力低落而有二次性濡染爆发，如 Aspergillus濡染或细菌性濡染等，于是也大概死于二次性濡染[39,45】。 2．4鹦鹉喙羽病的剖检病变及构制学转变 急性病例剖检可睹法氏囊、胸腺等免疫器官坏死性病变。急性濡染第一次长羽期的 小雏，可形成败血症性肺炎及肠炎，紧张时可致死。急性去世的病因也大概是急性肝炎； 而大家半去世病例众为二次濡染形成。分别岁数去世患鸟病理剖检结果基础适合病毒的 湮没期次序，即病毒初期侵袭胸腺、法氏囊等免疫器官，然后渐渐扩展到更寻常的内脏， 最终打破外皮惹起肉眼可睹的羽过错变。对待濡染时分较长的病例，其皮肤有角质化现 象并伴有外皮众发性增生。羽毛上皮细胞胞浆增加、坏死，羽鞘厚度特地、脆性增大。 羽毛罗列零乱，患鸟羽毛颜色大概因其羽毛机合特地而爆发调动。而对待急性濡染去世 的患鸟，其羽毛众无显然损害【291。构制切片镜检，可正在法氏囊、胸腺、脾脏、甲状旁腺、 肝脏、胃肠道、羽毛、羽囊、喙和皮肤等器官构制的上皮细胞中观测到嗜碱性核内宥恕 体；正在上述脏器巨噬细胞中可查睹胞浆内宥恕体。羽毛超薄切片可睹晶格状罗列的病毒 颗粒。 2．5鹦鹉喙羽病的通行病学 PBFDV可经秤谌撒播，由羽毛、皮屑和尿液粪便排毒，再经由口腔或呼吸道濡染。 也可笔直撒播，因大局部鸟濡染后会有病毒血症，产蛋后濡染雏鸟，因此选取种鸟时应 做好病毒的检测事务Il2。畜主应做好应做好平常的喂养治理及防疫步调。 inhibition 大利正在宠物鸟的通行病学视察中，以PcR检测笼饲鹦鹉的PBFDV阳性率，正在分别地域来 源的1516只无症状的鹦鹉中，有122只映现阳性反响，阳性率为8．05％[211。 2．6鹦鹉喙羽病的诊断及医治 青岛农业大学硕士学位论文 文献综述 PBFDV濡染症通过临床症状、分外病变以及剖检病变，可做出开始诊断，再凭据 其构制病理学、病原判定的结果举办确诊。试验室诊断手腕有血液凝聚试验 (haemagglutinationassay，HA)、血液凝聚控制试验(hemagglutinationinhibition，HI)u4’49】、 electron PCR[43,47-48]、电子显微镜法【50。51]、免疫电子显微镜法(Immune microscopy)[14】、 Shuttle PCR)[27】及及时荧光定量PCR(Novelreal。time 原位杂合反响、双重PCR(Duplex PCR)lj叫等手腕。 PBFDV构制特异性强，养分央浼高，体外提拔至今尚未相当告成。除CIAV外， 其他禽类的圆环病毒均不行正在各样细胞系及鸡胚中增殖【521。固然得回大批的纯化病毒非 常障碍，可是患鸟是举办遗传学及免疫学磋商的独一的病毒根源。用来自羽毛匀浆的纯 salmon．crested cockatoo(Cacmua moluccensis)的羽毛匀浆接种初始鸡胚成纤维细胞能分 目前，对待鹦鹉或其他禽类的圆环病毒濡染还没有有用的医治手腕。医治只可以支 持疗法为主，再助手省得疫煽动剂，最紧要的是应加紧情况干净。PBFDV的致病性及 危险性较量微小，鸟只简单濡染圆环病毒时不会形成显然危险，众半濡染圆环病毒的禽 类死于病毒、细菌、原虫或真菌的继发濡染，应注意诊断惹起继发濡染的病原并举办相 应的医治。试验磋商证明对鹦鹉举办免疫接种是有用的，因此最有用的防御格式是疫苗 打针。目前尚未有效于防御PBFD的有用商品化疫苗，因为PBFDV全部灭活相当障碍， 况且此病毒对易感鸟具有高度濡染性，于是正在现实中利用来自濡染鸟构制的全病毒灭活 苗瑕瑜常危急的。目前磋商以繁荣重组基因亚单元疫苗为主，然而现正在仍正在磋商阶段， 尚未有商品化疫苗问世【41,44】。 基于鸟场疾病的防御，畜主应做好应做好平常的喂养治理及自卫防疫步调。喂养管 理后应加紧鸟只的养分需要，饲料中增加适量维他命及微量元素，以抬高鸟只的免疫抵 抗力。引进新鸟时，务必注意鸟场的防疫情景及鸟只的壮健状况，购入之后需先隔绝观 察，方可与场内鸟只混养，且尽量避免将分别日龄的鸟只混淆喂养，加紧统进、统出策 略。鸟场如察觉有疑似疫情爆发时，应检送病材至兽病院举办确诊，以理清病因，省得 形成自己耗损，并注意将病鸟举办隔绝，正经节制职员的进出【12,57]。 3磋商的目标道理 鹦鹉养殖是一个年青的家当，具有开阔的繁荣前景。目前，我邦对鹦鹉疾病的干系 磋商相对来说较量单薄。正在喂养鹦鹉历程中，常睹的病毒性疾病中，禽众瘤病毒濡染症 和鹦鹉喙羽病被以为是影响禽类羽毛,ta夕t-观的两大代外性的病毒性疾病。 14 青岛农业大学硕士学位论文 文献综述 全基因组举办了测序领会。愚弄软件对序列举办众重比对及体系进化树领会，对病毒的 遗传进化做出合理的剖断，对APV和PBFDV的分子通行病学的磋商供应按照，对我 有利的接济。 PBFDV的ORFCl编码的衣壳卵白是组成濡染性病毒颗粒的要紧因素，是机体免疫 看管的大概对象，具有较好的免疫原性，于是C1基因成为研制疫苗及检测的首选基因。 本文对ORFCl编码的衣壳卵白举办了外达，卵白外达的PBFDV重组衣壳卵白可能作 为免疫原制各抗血清及单克隆抗体，也为研制基因工程疫苗和诊断试剂盒供应必备的筛 选用试剂，诱导兽医师产执行。 青岛农业大学硕士学位论文 禽众瘤病毒濡染症及鹦鹉喙羽病的PCR检测 试验一禽众瘤病毒濡染症及鹦鹉喙羽病 的PCR检测 摘要 通过对来自山东青岛鹦鹉养殖场和潍坊养殖场的9份具有显然发病特点的鹦鹉病 养殖场的2份病料为APV和PBFDV羼杂濡染病例。这是我邦大陆初度报道鹦鹉喙羽 病，也是我邦大陆初度正在皋比鹦鹉报道禽众瘤病毒和鹦鹉喙羽病羼杂濡染病例。 01与GenBank中已揭橥的一齐序列 APV-VPl基因青岛株QD-JM01和潍坊株wF—GM 为82．0％一93．0％。 合头词：禽众瘤病毒；鹦鹉喙羽病；羼杂濡染 1试验资料 1．1样品的搜聚 2008年8月，从山东青岛即墨某两个鹦鹉养殖场(共存栏750只，小雏230只旁边， 小雏发病率高，病死率达80％以上；中大雏浮现厌食、拉稀，去世率较低)搜聚具有明 显发病特点的发病濒死鹦鹉及去世皋比鹦鹉5只，此中4只为小雏鹦鹉，1只为成年鹦鹉。 搜聚具有榜样羽毛发育毛病特点的发病去世皋比鹦鹉4只，均为小雏鹦鹉。 1．2质粒和菌株 克隆载体pGEM-Teasyvector，购I刍Promega有限公司，全长2981bp，领导有氨苄青 霉素抗性基因(Amp)和Lac基因，重组体可通过蓝白斑和氨苄抗性双重筛选判定。大肠杆 coliDH5 菌EscherichiaQ菌株，由中邦动物卫生与通行病学中央监测室留存。 1．3要紧器材酶及试剂 DNAzol 2xMasterPCR Reagent试剂，购自Invitrogen。TaqMix(TrackingDyes Column Extraction Including)，购自Biouniquer公司。EZ一10Spin DNAGel Kit，EZ一10 1^ 青岛农业大学硕士学位论文 禽众瘤病毒濡染症及鹦鹉喙羽病的PCR检测 ColumnPlasmidMini．Press Spin Kit，购自上海生物工程技巧任职有限公司。pGEM—Teasy 载体试剂盒，DNAMarker(DL2000、DLl5000)，T4DNA 宝生物公司。节制性内切酶EcoR Buffer、 葡萄糖、氯化钠、无水乙醇、氢氧化钠、无水氯化钙、蔗糖、甘油、6×Loading 溴化乙锭(EB)等其余试剂均为进口或邦产领会纯试剂。 1．4要紧试验仪器与修筑 ElmeterGen 超净事务台(北京东联哈尔仪器创设有限公司)、PCR扩增仪(Perkin PCR AmpSystem9600)、台式高速冷冻离心绪(德邦Heraeus BiofugeprimoR)、42。C可 调恒温水浴锅、16。C恒温轮回水浴(北京博医康试验仪器有限公司)、CR21F型高速冷 forma 冻离心绪(日本HITACHI)、恒温提拔箱(美邦Thermo 311)、HZQ．C气氛浴摇 (METER)、电子天平(德邦Sartorius 六一仪器厂)、紫外凝胶成像体系(美邦GeneGenius UVP型)、．70。C超低温冰箱(日本 三阳MDF．383E型)。 1．5所用溶液及其配制 所用溶液及其摆设，参照《分子克隆试验指南》【58]。 1．5．1 DNA提取用试剂 75％Z一．醇(VⅣ)：取75ml无水乙醇加去离子水定容至100ml，4℃储蓄备用。 1．5．2琼脂糖凝胶电泳所用溶液 4C避光留存。 lx 1．0％琼脂糖凝胶：100mL TAE缓冲液中插足1．09琼脂糖，加热至全部融解，稍 冷却后倒板。 Tris，57．1mL冰乙酸，100mL500mmol／L 50xTAE(Tris一乙酸)：2429 EDTA(pH8．01， 加蒸馏水至1000mL，室温留存备用。 1．5．3提拔基 LB液体提拔基：称取胰卵白胨10 10 g，酵母提取物5 mL的 g，NaCIg，插足950 L， 去离子水中，摇动容器直至全部融解，调理pH值至7．0，插足去离子水至总体积为l 121℃高压灭菌20 min。运用时凭据须要插足Amp，使Amp的终浓度为50／．tg／mL。 青岛农业大学硕士学位论文 禽众瘤病毒濡染症及鹦鹉喙羽病的PCR检测 AIG琼脂平板：称取胰卵白胨109，酵母提取物59，NaCl109，209琼脂粉，插足 950mL的去离子水中，摇动容器直至全部融解，调理pH值至7．0，插足去离子水至总 灭菌好的平皿中，约20mL／板，冷却凝集后，用报纸包好到置于4℃冰箱中备用。 2手腕 2．1禽众瘤和鹦鹉喙羽病的PCR检测 2．1．1引物计划 2．1．1．1禽众瘤病毒濡染症PCR检测引物计划 I、Sal 对引物，插足E．coR I节制性内切酶酶切位点，序列如下，估计扩增片断巨细 1000bp。 APV-VP1 以上引物由上海生工生物工程公司合成。 2．1．1．2鹦鹉喙羽病PCR检测引物计划 d、495bp，序列如下： 以上引物由上海生工生物工程公司合成。 2．1．2 DNAflCJ提取 搜聚濒死鹦鹉的心、肝、脾等脏器，加适量PBS磨碎后，将构制悬液置一20℃再三冻 融三次。将构制悬液12000 DNAzol的 rpm离，tj,5min，取250}lL_E清，插足到盛有750¨L EP管中，混匀安插3min。12000 rpm离一tj,10rain，取8009L置于新EP管中，插足500gL 无水乙醇，安插5min，7500 min，弃上清。插足lmL75％乙醇，12000 rpm离心5 rpm离 M 心2 8m min，弃上清。用20“LNaOH融解，置于一20。C留存备用。 2．1．
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